11/05/2013

Hướng dẫn sử dụng Primer3 để thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 2)

Primer3 gần đây đã được nâng cấp về giao diện và bổ sung thêm một số tính năng mới. Thông tin chi tiết về chương trình này được trình bày trong bài báo được công bố trên Nucleic Acids Research (impact factor: 8.026) năm 2012 với tiêu đề Primer3-new capabilities and interfaces bởi nhóm tác giả tại Đại học Heidelberg (Germany) và Duke-NUS Graduate Medical School (Singapore). Bài báo được cung cấp dưới dạng Open Access, các bạn có thể download miễn phí tại đây: http://nar.oxfordjournals.org/content/40/15/e115.long

Do Primer3 là chương trình mã nguồn mở nên nó có thể được chỉnh sửa về giao diện hoặc tích hợp vào nhiều phần mềm khác nhau. Trong phần 2 của chủ đề này tôi sẽ giới thiệu với các bạn giao diện mới của chương trình Primer3plus với những thông số mặc định phần nào đã tối ưu cho thiết kế primer.


Giao diện của Primer3:

Giao diện nền web: Primer3 (version 0.4.0) tại địa chỉ: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/




Giao diện nền web: Primer3web (version 4.0.0) tại địa chỉ: http://primer3.wi.mit.edu/




Giao diện trực quan Primer3Plus thiết kế theo Tab dễ sử dụng (Hình 1) 
tại địa chỉ: http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi



Hình 1. Giao diện chính của chương trình Primer3plus


A. Đối với PCR thông thường

1. Bạn để mục Load server settings ở chế độ mặc định (default) và ở thẻ (Tab) Main, hãy dán (paste) trình tự DNA của bạn vào khung trống (Hình 2).



Hình 2. Khai báo thẻ Main

2. Điều chỉnh các thông số ở thẻ General Settings (Hình 3):

Product size ranges: >= 250 bp để dễ quan sát trên gel agarose, bạn có thể tùy chỉnh theo nhu cầu của mình.

Primer size: 18-22 bp

Primer Tm: 57-63°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 3°C 

Primer GC%: 40-60



Hình 3. Khai báo thẻ General Settings

3. Điều chỉnh các thông số ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):

Max Poly-X: 4 
(trình tự mồi không nên có quá 4 nucleotides liên tiếp giống hệt nhau)

Max #N's: 0
(các nucleotide bị lỗi do giải trình tự ở dạng N phải được loại bỏ)

Number To Return: 1
(Số cặp mồi bạn muốn nhận được, tất nhiên bạn có thể thay số lượng)

Các thông số còn lại bạn có thể để ở chế độ mặc định.


Hình 4. Khai báo thẻ Advanced Settings

4. Pick primers (Hình 4) để nhận cặp mồi mong muốn (Hình 5)

Bạn có thể copy trực tiếp các trình tự primers (mũi tên) và xem kích thước của sản phẩm PCR (khung màu xanh).





Hình 5. Cặp mồi nhận được từ chương trình.


B. Đối với real-time PCR (qPCR)

1. Ở mục Load server settings (Hình 2) bạn chọn chế độ qPCR, rồi kích chọn nút Activate Settings (ngay phía dưới). Chế độ thiết kế mồi cho real-time PCR đã được thiết lập một cách cơ bản.

2. Trong thẻ General Settings bạn nên điều chỉnh một chút:

- Product size ranges: 120-180 bp (thông thường), bạn có thể tùy chỉnh từ 80-250 bp.

Primer size: 20-24 bp

Primer Tm: 60-64°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 1°C 

Primer GC%: 40-60

3. Ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):

Max Self Complementarity: 3 hoặc 4

- Các thông số còn lại giống với PCR thông thường.


C. Kiểm tra cặp mồi sẵn có

Bạn có thể dán (paste) trực tiếp cặp mồi cần kiểm tra cho một trình tự ADN nhất định vào mục Left primer and Right primer ở đáy cửa sổ của giao diện chính của chương trình (Hình 1). Sau đó chọn Pick Primers.

Đôi khi bạn phải thiết kế cặp mồi để khuếch đại toàn bộ trình tự mã hóa của một gen (Open Reading Frame - ORF), nghĩa là trình tự cặp mồi của bạn phải cố định ở hai đầu của ORF. Trong nhiều trường hợp Primer3 sẽ báo cho bạn là cặp mồi này không tốt do self-complementary, 3' stability, too high temperature, ... Với tình huống này bạn không cần lo lắng, cứ tiến hành chạy PCR (có thể cần thêm chút DMSO). Nếu trên Gel điện di có nhiều hơn một band mong muốn, hãy xác định sản phẩm PCR của bạn dựa vào kích thước. Bạn cũng có thể kiểm tra hiệu quả khuếch đại của cặp mồi với máy Gradient PCR (sử dụng một dải các nhiệt độ khác nhau).


Chúc các bạn thành công.

10/05/2013

RNA interference (RNAi) trong nghiên cứu nấm

By Tuan Tran, Department of Microbiology, VNU University of Science (Vietnam).


Trong những năm gần đây RNAi (RNA interference) / RNA silencing đã được ứng dụng nhiều trong điều tra vai trò của các gene mong muốn ở nhiều loài nấm sợi (nấm mốc). Để nghiên cứu chức năng của một gene, sẽ là lý tưởng nếu gene này được loại bỏ hoàn toàn khỏi genome của nấm nhờ phương pháp xóa gene (gene deletion/disruption) thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination). Tuy nhiên, genome (hệ gene) của nhiều loài nấm vẫn chưa được giải trình tự hoặc chỉ được giải trình tự một phần. Do đó việc xóa gene sẽ phức tạp hoặc không khả thi. Trong trường hợp này RNAi trở thành một lựa chọn tối ưu. 
Ngoài ra RNAi cũng vô cùng hữu ích trong việc làm giảm sự biểu hiện của một gene với 2 alleles tương đồng ở một số nấm có genome lưỡng bội (diploid), mà việc xóa bỏ cả 2 alleles là khó thực hiện. RNAi cũng được sử dụng để nghiên cứu vai trò của các gene cần thiết (essential genes) mà việc xóa các gene này dẫn đến các thể đột biến không thể sống sót (lethal mutants).

Verticillium longisporum là một nấm lưỡng bội lây nhiễm và gây bệnh nghiêm trọng trên các cây trồng thuộc họ cải Brassicacae, trong đó có cây cải dầu (oilseed rape) Brassica napus được trồng nhiều ở các nước Châu Âu, Canada và Trung Quốc để sản xuất dầu ăn và dầu cho động cơ (biodiesel). Loài nấm này được hình thành từ sự kiện lai giữa hai loài gần gũi có genome đơn bội (haploid) là Verticillium dahliae và một loài chưa xác định nhưng giống với Verticillium albo-atrum

Verticillium longisporum (lây nhiễm chỉ các cây họ cải) V. dahliae (lây nhiễm hơn 200 loài thực vật khác nhau) cư trú bên trong hệ mạch của các thực vật chủ và có khả năng sống sót khoảng 15 năm trong đất dưới dạng thể nghỉ microsclerotia. Do đó việc tiêu diệt 2 loài nấm này là vô cùng khó khăn. 

Trong hai nghiên cứu sau, sự biểu hiện của các gene Vlaro2 và CPC1/CpcA chịu trách nhiệm cho quá trình sinh tổng hợp các axit amin ở nấm Verticillium bị ức chế đến 80-85% bởi RNAi (RNA silencing). Việc thiếu hụt các protein mã hóa bởi các gene trên dẫn đến sự suy giảm độc lực của nấm trên cây trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm.




Silencing of Vlaro2 for chorismate synthase revealed that the phytopathogen Verticillium longisporum induces the cross-pathway control in the xylem.

Singh S, Braus-Stromeyer SA, Timpner C, Tran VT, Lohaus G, Reusche M, Knüfer J, Teichmann T, von Tiedemann A, Braus GH.


(Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Feb;85(6):1961-76. doi: 10.1007/s00253-009-2269-0)


Abstract
The first leaky auxotrophic mutant for aromatic amino acids of the near-diploid fungal plant pathogen Verticillium longisporum has been generated. This fungus enters its host Brassica napus through the roots and colonizes the xylem vessels. The xylem contains little nutrients including low concentrations of amino acids. We isolated the gene Vlaro2 encoding chorismate synthase by complementation of the corresponding yeast mutant strain. Chorismate synthase produces the first branch point intermediate of aromatic amino acid biosynthesis. A novel RNA-mediated gene silencing method reduced gene expression of both isogenes by 80% and resulted in a bradytrophic mutant, which is a leaky auxotroph due to impaired expression of chorismate synthase. In contrast to the wild type, silencing resulted in increased expression of the cross-pathway regulatory gene VlcpcA (similar to CpcA/GCN4) during saprotrophic life. The mutant fungus is still able to infect the host plant B. napus and the model Arabidopsis thaliana with reduced efficiency. VlcpcA expression is increased in planta in the mutant and the wild-type fungus. We assume that xylem colonization requires induction of the cross-pathway control, presumably because the fungus has to overcome imbalanced amino acid supply in the xylem.


Original research article: 

Download this paper: 




The Cpc1 Regulator of the Cross-Pathway Control of Amino Acid Biosynthesis Is Required for Pathogenicity of the Vascular Pathogen Verticillium longisporum.

Timpner C, Braus-Stromeyer SA, Tran VT, Braus GH.

(Mol Plant Microbe Interact. 2013 Nov;26(11):1312-24. doi: 10.1094/MPMI-06-13-0181-R)


Abstract

The plant-pathogenic fungus Verticillium longisporum is a causal agent of early senescence and ripening in cruciferous crops like Brassica napus. Verticillium wilts have become serious agricultural threats in recent decades. Verticillium species infect host plants through the roots and colonize xylem vessels of the host plant. The xylem fluid provides an environment with limited carbon sources and unbalanced amino acid supply, which requires V. longisporum to induce the cross-pathway control of amino acid biosynthesis. RNA-mediated gene silencing reduced the expression of the two CPC1 isogenes (VlCPC1-1 and VlCPC1-2) of the allodiploid V. longisporum up to 85%. VlCPC1 encodes the conserved transcription factor of the cross-pathway control. The silenced mutants were highly sensitive to amino-acid starvation, and the infected plants showed significantly fewer symptoms such as stunting or early senescence in oilseed rape plant infection assays. Consistently, deletion of single CPC1 of the haploid V. dahliae resulted in strains that are sensitive to amino-acid starvation and cause strongly reduced symptoms in the plant-host tomato (Solanum lycopersicum). The allodiploid V. longisporum and the haploid V. dahliae are the first phytopathogenic fungi that were shown to require CPC1 for infection and colonization of their respective host plants, oilseed rape and tomato.

Original research article: 




Chẩn đoán phân tử phân biệt nấm Verticillium longisporum gây bệnh trên cây cải dầu Brassica napus với các loài Verticillium gần gũi


Chi nấm Verticillium gồm 5 loài gây bệnh héo (wilt disease) trên thực vật là V. dahliae, V. longisporumV. albo-atrum, V. tricorpus V. nubilum. Trong đó V. dahliaeV. longisporumV. albo-atrum là những loài gây bệnh nghiêm trọng nhất cho hơn 300 loại cây khác nhau trên toàn thế giới. Nhiều cây trồng quan trọng về mặt kinh tế như dâu tây, cà chua, khoai tây, bông, cây hoa bia, cây cải dầu, cây ôliu, hướng dương, súp lơ, bắp cải, xà lách, ... đều dễ bị tấn công bởi các loài nấm này. 

V. dahliaeV. albo-atrum có genome đơn bội (haploid) và hình thành các bào tử vô tính kích thước ngắn, nhưng lại khác nhau về cấu trúc thể nghỉ (resting structures). V. dahliae hình thành các microsclerotia, trong khi V. albo-atrum sản sinh hệ sợi màu tối cho quá trình sống sót lâu dài trong đất.

V. longisporum là một nấm lai (hybrid) với 3 dòng (lineage) khác nhau gồm A1xD1, A1xD2 và A1xD3. Loài này được hình thành do sự kết hợp genome của hai loài Verticillium gần gũi. Cả 3 dòng đều có chung phần genome của loài bố mẹ A1 (gần gũi V. albo-atrum), nhưng khác nhau một chút trong genome của loài bố mẹ thứ 2 là D1, D2 hoặc D3. Thực tế genome của D2 và D3 giống hệt với genome của một số chủng (strain) thuộc loài V. dahliae, trong khi D1 khác D2 và D3 chỉ bởi một số đột biến điểm. 

Hai dòng A1xD1 và A1xD3 của V. longisporum đã được tìm thấy trên các cây họ cải nhiễm bệnh được trồng ở Nhật Bản, Châu Âu và Mỹ. Trong khi dòng A1xD1 gây ra các triệu chứng bệnh nghiêm trọng trên cây, thì dòng A1xD3 lây nhiễm cây nhưng lại không gây ra bất cứ triệu chứng bệnh đáng kể nào. Điều thú vị là cả hai dòng chỉ mang một loại ribosomal DNA (rDNA) hoặc từ loài A1 đối với dòng A1xD1 hoặc từ loài D3 đối với dòng A1xD3. rDNA của A1 rất giống với rDNA của V. albo-atrum, trong khi rDNA của D3 giống hệt với rDNA của V. dahliae.

V. longisporum sinh sản vô tính bằng hình thức hình thành bào tử đính (conidia) giống với V. dahliaeV. albo-atrum, nhưng kích thước bào tử lại dài gần gấp đôi (xem hình). Cả 2 dòng A1xD1 và A1xD3 đều hình thành thể nghỉ microsclerotia giống với V. dahliae. Nhận dạng chính xác 3 loài này từ tự nhiên thường yêu cầu nhiều bước tiến hành và có thể bị nhầm lẫn do sự không ổn định về mặt hình thái của chúng dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau trong phòng thí nghiệm. Do đó các chẩn đoán về mặt phân tử với các chỉ thị (marker) đặc hiệu sẽ hỗ trợ việc định loại chính xác loài và tiết kiệm thời gian. Các kết quả của nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí Applied Microbiology and Biotechnology (impact factor  2012: 3,689) và báo cáo tại Hội nghị Quốc tế lần thứ 11 về Verticillium tổ chức tại Göttingen từ 5-8/5/2013 (http://dpg.phytomedizin.org/de/11th-international-verticillium-symposium-2013/).      
















Hình thái bào tử và thể nghỉ của ba loài Verticillium điển hình (Tran et al., 2013)


Molecular diagnosis to discriminate pathogen and apathogen species of the hybrid Verticillium longisporum on the oilseed crop Brassica napus.

Tran VT, Braus-Stromeyer SA, Timpner C, Braus GH.

(Appl Microbiol Biotechnol. 2013 May;97(10):4467-83. doi: 10.1007/s00253-012-4530-1)


The cruciferous fungal pathogen Verticillium longisporum represents an allodiploid hybrid with long spores and almost double the amount of nuclear DNA compared to other Verticillium species. V. longisporum evolved at least three times by hybridization. In Europe, virulent A1xD1 and avirulent A1xD3 hybrids were isolated from the oilseed crop Brassica napus. Parental A1 or D1 species are yet unknown whereas the D3 lineage represents Verticillium dahliae. Eleven V. longisporum isolates from Europe or California corresponding to hybrids A1xD1 or A1xD3 were compared. A single characteristic type of nuclear ribosomal DNA could be assigned to each hybrid lineage. The two avirulent A1xD3 isolates carried exclusively D3 ribosomal DNA (rDNA) which corresponds to V. dahliae. The rDNA of all nine A1xD1 isolates is identical but distinct from D3 and presumably originates from A1. Both hybrid lineages carry two distinct isogene pairs of four conserved regulatory genes corresponding to either A1 or D1/D3. D1 and D3 paralogues differ in several single nucleotide polymorphisms. Southern hybridization patterns confirmed differences between the A1 and D1/D3 isogenes and resulted in similar patterns for D1 and D3. Distinct signatures of the Verticillium transcription activator (VTA)2 regulatory isogene pair allow identification of V. longisporum hybrids by a single polymerase chain reaction and the separation from haploid species as V. dahliae or Verticillium albo-atrum. The combination between VTA2 signature and rDNA type identification represents an attractive diagnostic tool to discriminate allodiploid from haploid Verticillia and to distinguish between A1xD1 and A1xD3 hybrids which differ in their virulence towards B. napus.