11/05/2013

Hướng dẫn sử dụng Primer3 để thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 2)

By Tuan Tran, Department of Microbiology, VNU University of Science (Vietnam).


Primer3 gần đây đã được nâng cấp về giao diện và bổ sung thêm một số tính năng mới. Thông tin chi tiết về chương trình này được trình bày trong bài báo được công bố trên Nucleic Acids Research (impact factor: 8.026) năm 2012 với tiêu đề Primer3-new capabilities and interfaces bởi nhóm tác giả tại Đại học Heidelberg (Germany) và Duke-NUS Graduate Medical School (Singapore). Bài báo được cung cấp dưới dạng Open Access, các bạn có thể download miễn phí tại đây: http://nar.oxfordjournals.org/content/40/15/e115.long

Do Primer3 là chương trình mã nguồn mở nên nó có thể được chỉnh sửa về giao diện hoặc tích hợp vào nhiều phần mềm khác nhau. Trong phần 2 của chủ đề này tôi sẽ giới thiệu với các bạn giao diện mới của chương trình Primer3plus với những thông số mặc định phần nào đã tối ưu cho thiết kế primer.


Giao diện của Primer3:

Giao diện nền web: Primer3 (version 0.4.0) tại địa chỉ: http://frodo.wi.mit.edu/




Giao diện nền web: Primer3web (version 4.0.0) tại địa chỉ: http://primer3.wi.mit.edu/




Giao diện trực quan Primer3Plus thiết kế theo Tab dễ sử dụng (Hình 1) 
tại địa chỉ: http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi



Hình 1. Giao diện chính của chương trình Primer3plus


A. Đối với PCR thông thường

1. Bạn để mục Load server settings ở chế độ mặc định (default) và ở thẻ (Tab) Main, hãy dán (paste) trình tự DNA của bạn vào khung trống (Hình 2).




Hình 2. Khai báo thẻ Main

2. Điều chỉnh các thông số ở thẻ General Settings (Hình 3):

- Product size ranges: >= 250 bp để dễ quan sát trên gel agarose, bạn có thể tùy chỉnh theo nhu cầu của mình.

- Primer size: 18-22 bp

- Primer Tm: 57-63°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 3°C 

- Primer GC%: 40-60




Hình 3. Khai báo thẻ General Settings

3. Điều chỉnh các thông số ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):

Max Poly-X: 4 
(trình tự mồi không nên có quá 4 nucleotides liên tiếp giống hệt nhau)

Max #N's: 0
(các nucleotide bị lỗi do giải trình tự ở dạng N phải được loại bỏ)

Number To Return: 1
(Số cặp mồi bạn muốn nhận được, tất nhiên bạn có thể thay số lượng)

Các thông số còn lại bạn có thể để ở chế độ mặc định.


Hình 4. Khai báo thẻ Advanced Settings

4. Pick primers (Hình 4) để nhận cặp mồi mong muốn (Hình 5)

Bạn có thể copy trực tiếp các trình tự primers (mũi tên) và xem kích thước của sản phẩm PCR (khung màu xanh).





Hình 5. Cặp mồi nhận được từ chương trình.


B. Đối với real-time PCR (qPCR)

1. Ở mục Load server settings (Hình 2) bạn chọn chế độ qPCR, rồi kích chọn nút Activate Settings (ngay phía dưới). Chế độ thiết kế mồi cho real-time PCR đã được thiết lập một cách cơ bản.

2. Trong thẻ General Settings bạn nên điều chỉnh một chút:

- Product size ranges: 120-180 bp (thông thường), bạn có thể tùy chỉnh từ 80-250 bp.

Primer size: 20-24 bp

Primer Tm: 60-64°C, với nhiệt độ chênh nhau tối đa giữa hai mồi (Max Tm Difference) là 1°C 

Primer GC%: 40-60

3. Ở thẻ Advanced Settings (Hình 4):

- Max Self Complementarity: 3 hoặc 4

- Các thông số còn lại giống với PCR thông thường.



C. Kiểm tra cặp mồi sẵn có

Bạn có thể dán (paste) trực tiếp cặp mồi cần kiểm tra cho một trình tự ADN nhất định vào mục Left primer and Right primer ở đáy cửa sổ của giao diện chính của chương trình (Hình 1). Sau đó chọn Pick Primers.

Đôi khi bạn phải thiết kế cặp mồi để khuếch đại toàn bộ trình tự mã hóa của một gen (Open Reading Frame - ORF), nghĩa là trình tự cặp mồi của bạn phải cố định ở hai đầu của ORF. Trong nhiều trường hợp Primer3 sẽ báo cho bạn là cặp mồi này không tốt do self-complementary, 3' stability, too high temperature, ... Với tình huống này bạn không cần lo lắng, cứ tiến hành chạy PCR (có thể cần thêm chút DMSO). Nếu trên Gel điện di có nhiều hơn một band mong muốn, hãy xác định sản phẩm PCR của bạn dựa vào kích thước. Bạn cũng có thể kiểm tra hiệu quả khuếch đại của cặp mồi với máy Gradient PCR (sử dụng một dải các nhiệt độ khác nhau).  


My paper using Primer3 has been recently published. It might be interesting for you.
(http://sinhhocphantu.blogspot.de/2013/05/molecular-diagnosis-to-discriminate.html)



Nếu bạn đăng lại bài viết này trên một website khác, vui lòng trích dẫn sinhhocphantu.blogspot.com




3 nhận xét:

Thông Nguyễn nói...

Cảm ơn bạn đã có bài viết hữu ích cho nhung nguoi moi tim hieu ve primer.

Thông Nguyễn nói...

Neu duoc, xin cac ban vui long cho minh xin so dien thoai de lien lac. khong biet cac ban co ai lam lĩnh vuc sinh hoc phan tu kh? neu co co the gioi thieu cong ty cac ban dang lam duoc kh? minh dang lam luan van tot nghiep thac sy, do chuyen nganh hoa hoc nhung minh lai lam de tai co lien quan den sinh hoc phan tu, vi the minh chua ro. rat mong cac ban hoi am

Wind Dani nói...

Cho hỏi chương trình này có thể thực hiện chương trình PCR để nhân chọn lọc đoạn gene ko thầy nhỉ?